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2022-09-24 11:48:58 By : Ms. Doris Wang

Gracias por visitar nature.com.Está utilizando una versión de navegador con soporte limitado para CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador más actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 2501 (2022) Citar este artículoLa síntesis de proteínas está respaldada por mecanismos celulares que aseguran que los polipéptidos se plieguen a su conformación nativa, al tiempo que eliminan las especies propensas a la agregación mal plegadas.La agregación de proteínas es la base de patologías que incluyen la neurodegeneración.La formación de agregados es antagonizada por chaperonas moleculares, con maquinaria citoplasmática que resuelve agregados de proteínas insolubles.Sin embargo, se desconoce si existe un sistema de desagregación análogo en el retículo endoplásmico (ER) donde se sintetiza ~30% del proteoma.Aquí mostramos que el ER de una variedad de tipos de células de mamíferos, incluidas las neuronas, está dotado de la capacidad de resolver los agregados de proteínas bajo estrés.Utilizando un sistema de sondeo de agregación de proteínas especialmente desarrollado con una resolución suborganellar, observamos la acumulación de agregados en estado estacionario en la sala de emergencias.La inducción farmacológica del estrés del RE no aumenta los agregados, sino que estimula su eliminación en cuestión de horas.Mostramos que esta actividad de desagregación es catalizada por la chaperona molecular ER sensible al estrés - BiP.Este trabajo revela una hebra no redundante hasta ahora desconocida de la respuesta al estrés del RE restaurador de la proteostasis.Los polipéptidos recién sintetizados deben alcanzar la conformación tridimensional funcional, codificada termodinámicamente por la secuencia de aminoácidos1.El plegamiento de proteínas describe el proceso en el que los polipéptidos buscan el punto mínimo en el embudo de energía, pero pueden quedar atrapados en mínimos locales separados por barreras bajas (trampas de plegamiento incorrecto2).Además, la diversidad química y el hacinamiento de los compartimentos celulares crean condiciones para reacciones que compiten con el plegamiento nativo, induciendo el despliegue local y estabilizando conformaciones no funcionales atrapadas en el plegamiento incorrecto.Las especies de proteínas desplegadas y mal plegadas tienden a formar agregados insolubles3.Para evitar la acumulación de agregados citotóxicos, los orgánulos biosintéticos (es decir, el citoplasma, el retículo endoplásmico, el RE y las mitocondrias) desarrollaron una red de proteostasis (PN) multicapa que acompaña a las proteínas nacientes y rescata o recicla los intermediarios mal plegados4.La PN está dotada de la capacidad de retroalimentar los sistemas de transcripción y traducción de genes para ajustar de forma interactiva la tasa de producción de proteínas a su capacidad de control de calidad y asistencia al plegamiento.La rama ER de la PN, la respuesta de proteínas desplegadas (UPR), alivia la carga de proteínas no plegadas o mal plegadas durante el estrés mediante la atenuación transitoria de la síntesis de proteínas y la activación de la chaperona postraduccional, seguida de la regulación positiva transcripcional de la maduración de proteínas y los factores de control de calidad5,6.Las deficiencias de la maquinaria de la NP pueden dar lugar a patologías: la agregación de proteínas acompaña a enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal7.Proteínas metaestables expresadas neuronalmente (p. ej., Aβ, Tau o α-sinucleína), con tendencia a la oligomerización y, en consecuencia, a la agregación, son la base de estas condiciones.El inicio tardío de la neurodegeneración subpoblacional relacionada con la agregación es consistente con la disminución de la eficiencia de la maquinaria PN dependiente de la edad y del factor ambiental.Comprender cómo la célula maneja las proteínas propensas a la agregación a nivel de organelos es crucial para racionalizar el deterioro de la proteostasis relacionada con la enfermedad.El reciente descubrimiento de la chaperona citosólica Hsp70 y la capacidad de su sistema de asistencia para resolver los agregados citoplasmáticos8 (incluidos los amiloides9,10) agrega otra capa funcional a la NP para rectificar las imperfecciones del sistema de control de calidad o la transición similar a un prión desde el plegamiento nativo a la agregación.Sin embargo, se desconoce si tal capacidad existe en la sala de emergencias, un sitio responsable de la fabricación de aproximadamente un tercio del repertorio de proteínas de la célula (incluidos los determinantes de enfermedades, por ejemplo, la proteína precursora de amiloide, APP).Las observaciones sugieren que el entorno rico en chaperonas del RE es más inmune a la agregación de proteínas que el citoplasma11.Cómo el orgánulo mantiene el plegamiento de proteínas de alta fidelidad, evitando la agregación a lo largo de la vida de la célula, particularmente las neuronas que no se dividen, sigue siendo una pregunta abierta.Explicar esto en términos de control de calidad de plegamiento de proteínas solo se basaría en la suposición de que el sistema puede lograr una agregación cero y un control de calidad absoluto a través de un número astronómicamente grande de ciclos de plegamiento de proteínas.En este trabajo, utilizamos un sistema de sondeo de agregación de proteínas especialmente desarrollado con resolución suborgánica para mostrar la acumulación de agregados de proteínas en la sala de emergencias.Sorprendentemente, el estrés del RE, inducido por la N-glicosilación o los inhibidores de la bomba de Ca2+, desencadena una actividad de eliminación de agregados.Encontramos que la desagregación de proteínas es catalizada por la chaperona molecular ER sensible al estrés: BiP.La modulación de su cantidad en el RE revela una correlación inversa entre la presencia de BiP y la carga de agregación.Además, reconstruimos la reacción de desagregación in vitro mediante un sistema mínimo de BiP alimentado con ATP con un cofactor de dominio J.Buscamos un enfoque de sondeo de agregado de proteína unicelular óptica con resolución de espacio subcelular para superar las limitaciones asociadas con los extractos de población de células bioquímicas posteriores a la lisis.Las técnicas de sondeo de lisado pueden detectar eventos de agregación en una población que implican cambios drásticos en una alta proporción de una proteína agregada.Sin embargo, el efecto promedio de la población heterogénea en los análisis de conjunto, combinado con la falta de información sobre la distribución de la sonda en el espacio y la dependencia de la conservación del estado de la proteína en la lisis limitan la capacidad de resolver especies plegadas/mal plegadas/agregadas de sustrato metaestable.El estado de plegamiento de la proteína reportera metaestable, que puede asumir cualquier estado, puede reflejar la actividad de la maquinaria de manejo del plegamiento de la proteína celular.Por lo tanto, para abordar cómo el ER maneja el plegamiento/agregación de proteínas, establecimos un enfoque óptico para monitorear este proceso en células vivas basado en una proteína sustituta metaestable inerte celular.El núcleo proteico de la sonda es una variante de haloalcano deshidrogenasa de E. coli desestabilizada por mutagénesis y modificable covalentemente por un resto fluorescente solvatocrómico (Fig. 1a) ^{12} HT-aggr aquí.Como HT-aggr no tiene una función natural ni interactúa en el RE, su destino (en términos de plegamiento, agregación y degradación) refleja exclusivamente la actividad de manipulación de proteínas en el orgánulo huésped.a Representación esquemática del sistema de sondeo HT-agr.b Función de autocorrelación normalizada (G(τ) − 1) a partir de mediciones de espectroscopia de correlación de fluorescencia de la sonda HT-aggr (K73T) purificada, nativa o agregada por calor o (c) HaloTag de tipo salvaje (HT-WT), marcada con el fluoróforo solvatocrómico P114.Las líneas continuas representan los mejores ajustes de la función de autocorrelación considerando una sola especie para HT-aggr y HT-WT, y dos especies para HT-WT agregado por calor, como lo muestran los valores del radio hidrodinámico en el recuadro.d, e Histogramas de vida útil de fluorescencia de muestras en (b, c), respectivamente.f Una serie temporal de micrografías de vida útil de fluorescencia de células vivas (FLIM) de HT-aggr (K73T) expresadas transitoriamente en el ER o el citoplasma de las células COS7, antes y después de la exposición a un tratamiento de choque térmico (43 °C), imágenes representativas de tres experimentos independientes.g Histogramas de vida útil de fluorescencia de la serie de imágenes que se muestra en f, (las trazas verde, amarilla, naranja y rosa representan los puntos de tiempo antes del choque térmico de 5, 15 y 35 minutos, respectivamente).h valores de vida útil de fluorescencia de células individuales como en (f).La propensión a la agregación de la sonda HT-aggr se predice mediante un valor de energía libre de despliegue relativamente bajo (ΔG0unf disminuyó de 5,6 kcal/mol en HT-WT a 2,0 kcal/mol en HT-aggr K73T, figura complementaria 1).Esta metaestabilidad, propensión a agregarse, se reflejó en las mediciones de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS): al calentar in vitro, HT-agr formó partículas con un radio hidrodinámico (Rh) de 48 nm, mientras que HT-WT solo se agregó parcialmente en las mismas condiciones. que muestra un rastro de FCS bifásico, que representa monómeros putativos y agregados más grandes (el Rh predicho de un HT globular de 26 kDa de 2,9 nm concuerda con el tamaño de monómero medido por FCS de 2–3 nm, Fig. 1b, c, consistente con 13) .Además, observamos un aumento en la vida útil de la fluorescencia del fluoróforo solvatocrómico unido a las especies de sonda agregadas (Fig. 1d, e).El HT-aggr nativo y el HT-WT mostraron una distribución unimodal de tiempos de vida con un pico de ~ 3.3 ns que se amplió y cambió al calentarse a valores de vida útil más largos con una meseta irregular entre 4.9 y 7.6 ns para HT-aggr (Fig. 1d) y dos picos distintos para HT-WT (Fig. 1e) correspondientes a monómeros y agregados grandes, evidentes en las trazas de FCS (Fig. 1c).Esta equivalencia entre el tiempo de vida de fluorescencia de la sonda y el estado de agregación (Fig. 1a) proporciona medios para monitorear el estado de la sonda de agregación en células vivas mediante microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM).Esta metodología ofrece una medida precisa y absoluta del estado de la sonda, libre de los efectos de confusión de las calibraciones de intensidad y el fotoblanqueo14,15,16, eliminando así los límites asociados con las lecturas basadas en la intensidad.Basándonos en el rendimiento in vitro de la sonda, buscamos establecer mediciones basadas en FLIM de su estado de plegamiento/agregación en células vivas.De acuerdo con las mediciones in vitro, el estrés por calor desencadenó la agregación de HT-aggr, expresada transitoriamente en el citoplasma o ER, según lo registrado por un aumento en la vida útil de la fluorescencia de las sondas (Fig. 1f, g).Este comportamiento no se observó para HT-WTER (Figura 2 complementaria).De acuerdo con las observaciones anteriores11,17, el ER parecía más resistente que el citoplasma para mantener la solubilidad de HT-agr en células sometidas a un choque térmico, como se refleja en un cambio atenuado hacia una vida útil más larga de la fluorescencia en el ER, en comparación con la sonda residente en el citoplasma.En particular, el aumento en la vida útil de la fluorescencia de la sonda dirigida a ER tras el choque térmico es considerablemente más heterogéneo en magnitud en la población celular que el de la sonda citoplásmica (Fig. 1h).Esto apunta a una mayor resiliencia del RE a la agregación de proteínas en algunas células (compare HT-aggrER con HT-aggrcyto en la Fig. 1h, observe la presencia de células HT-aggrER más/menos sensibles al calor reflejadas en su FLIM- amarillo/verde). apariencia, respectivamente).Como las proteínas localizadas en ER experimentan N-glicosilación si su secuencia contiene un tripéptido Asp-X (excepto Pro) -Ser/Thr expuesto, una modificación que podría alterar las propiedades de HT-agr, confirmamos que la secuencia HT carece de esta señal.Para evaluar la cinética a largo plazo de la agregación de HT-aggrER, entregamos su vector de codificación en un vehículo retroviral que impulsa la integración genómica y, por lo tanto, la expresión estable.Al rastrear el estado de agregación posterior a la infección, observamos que la expresión prolongada de la sonda en el RE condujo a la agregación espontánea de HT-agr con una acumulación de partículas agregadas grandes (aparentes como puntos rojos: vida útil> 5 ns, similar a los valores de los agregados in vitro, Fig. 2a).En particular, la población de píxeles con un patrón ER regular (no punteado) también mostró una vida útil más larga (píxeles en el espectro amarillo), lo que presumiblemente refleja un menor límite de subdifracción intermedios/oligómeros de agregación mezclados con sonda nativa (mezcla de verde y rojo). , Fig. 2a, b).La fracción de células con agregados detectables por FLIM (puntos rojos) aumentó con el tiempo hasta 9 días (Fig. 2c).A partir de ese momento, la distribución del tamaño de los agregados se desplazó con el tiempo hacia partículas más grandes (Fig. 2d), lo que indica una mayor acumulación de material agregado.a Serie temporal de micrografías FLIM de células CHO-K1 después de una infección retroviral estable con sonda HT-aggr dirigida a ER (K73T), marcada con fluoróforo P1.ER-objetivo de HT como en la ref.36. b Gráfico de los valores medios de vida útil de la fluorescencia de HT-aggrER/P1 para los puntos de tiempo en (a).c Gráfico del porcentaje de células con agregados detectables por FLIM (vida útil > 5 ns, aparente como puntos rojos, el umbral establecido para visualizar agregados en casi monocromáticos) de la serie de imágenes como en (a).d Distribución de frecuencia de los tamaños de los agregados extraídos de la serie temporal FLIM como en (a) usando el detector de agregados, algoritmo Icy.(en (b, c) se muestran valores de media ± SEM, n = 7 campos de visión independientes con al menos 20 celdas cada uno).e Proyecciones rápidas de imágenes 3D FLIM de alta resolución de células CHO-K1 con HT-aggrER/P1.f Imágenes FLIM de células CHO-K1 vivas que expresan de manera estable variantes de HT-WTER o HT-aggrER con varios grados de metaestabilidad, como lo indican los valores de energía libre de Gibbs de despliegue (ΔG0Unf), (h) recuadro.g Gráfico del área de celda relativa ocupada por agregados detectados por FLIM (tiempo de vida> 5 ns, puntos rojos) cuantificados para las variantes de HT-aggr de imágenes como en (f).(media ± SEM, n = 3 campos de visión independientes, 60, 42, 55 y 45 células analizadas para las variantes WT, K73T, L172Q y M21K F86L, respectivamente).h Gráfica del área de celda relativa con agregados (una medida de agregación de (g) para cada variante) en función de su metaestabilidad, representada por la constante de equilibrio de despliegue, expresada como KUnf = exp(−ΔG0Unf/RT)21, donde ΔG0Unf es la energía libre del despliegue (recuadro).i Curvas de crecimiento para células CHO-K1 que expresan las variantes HT-aggrER (WT, cian; K73T, amarillo; L172Q, naranja; M21KF86L, rojo) junto con células parentales (magenta).Las líneas continuas son los ajustes para el crecimiento exponencial según la ecuación % conft = % conft0 2 (t/td), donde td es el tiempo de duplicación.Los valores individuales y las desviaciones estándar de td calculadas a partir de triplicados se muestran en el recuadro.*P < 0,05;**P < 0,01;***P < 0,001;****P < 0,0001, prueba T no pareada (dos colas).Para establecer si las especies agregadas se acumulan en la luz del RE o si se retrotranslocaron al citoplasma, implementamos el enfoque de superresolución Lightening junto con 3D FLIM habilitado a través de una mejora considerable en la velocidad del conteo de fotones individuales correlacionados con el tiempo. de esta modalidad18.Tanto los agregados grandes, similares a puntos (rango de vida útil en rojo) como los intermedios (rango de vida útil en amarillo) mostraron una localización intra-ER completa en el FLIM 3D rápido de alta resolución (Fig. 2e, Película complementaria 1).De manera consistente, la inhibición de la retrotranslocación 19 no eliminó la formación de agregados (Figuras complementarias 3a, b).Además, los análisis de colocalización de la señal de los agregados con un marcador de ER en células no tratadas y tras la inhibición de la retrotranslocación mostraron una población de ER similar en ambas condiciones (Fig. 3a, b complementarias).También se pudo medir un alto grado de colocalización entre un marcador de ER y toda la población de HT-aggrER en condiciones normales y tras la inhibición de la retrotranslocación (Fig. 3c complementaria).Por lo tanto, HT-aggrER no se acumula en el citoplasma posterior a la retrotranslocación (como era de esperar, como para la mayoría de las proteínas ER, la degradación está acoplada a la retrotranslocación de la degradación asociada a ER, ERAD20).Además, el grado de agregación intracelular de las variantes de HT-aggrER (fracción de área celular ocupada por agregados) se correlacionó linealmente con su constante de equilibrio de despliegue, una medida de su fracción de despliegue21 (Fig. 2f-h).Las diferencias en la estabilidad termodinámica de las variantes de HT-agr explican el grado de propensión a la agregación de las variantes de HT-agr Fig. 2h, recuadro).Las propiedades de HT-aggr K73T sugieren que es una variante útil para monitorear la capacidad del control de calidad del plegamiento de proteínas celulares: esta sonda propensa a la agregación más suave mostró niveles de expresión en un estado estacionario similar a HT-WT (Película complementaria 2 para HT -aggr K73T y Película complementaria 3 para HT-WT), y una carga de agregados ER relativamente baja, pero detectable.Por lo tanto, FLIM de HT-aggr proporciona una medida de agregación resuelta en espacio/tiempo en células vivas, lo que revela que el RE rico en chaperonas no es inmune a la agregación de proteínas: los intermedios desplegados/mal plegados de un sustrato metaestable pueden evadir el sistema de control de calidad de plegado acumulándose con el tiempo en partículas agregadas intra-ER considerables.Los intermedios desplegados/mal plegados de las sondas y los agregados a los que dan lugar fueron bien tolerados sin costo para las tasas de proliferación celular (Fig. 2i) y no desencadenaron un aumento medible en la actividad UPR en ningún punto del período de acumulación de agregados ( Figura complementaria 4).Sorprendentemente, la imposición de estrés ER farmacológicamente no aumentó la fracción agregada de la sonda (Fig. 3).En estos experimentos, marcamos la sonda con pulsos con su ligando indicador fluorescente y perseguimos el destino de su subpoblación marcada a lo largo del tiempo en presencia o ausencia de varios tratamientos (es decir, inductores de estrés, bloqueadores de degradación).Este modo permite diseccionar los eventos de agregación, desagregación y degradación que está experimentando la proteína modelo.Es decir, una breve exposición al ligando HT fluorescente marca una subpoblación de especies de sonda preexistentes, cuyo destino luego se rastrea, sin mezclar de la población total que incluye especies producidas durante el período de persecución (la sonda oscura).Sorprendentemente, la inducción de estrés de ER disminuyó la agregación intra-ER: una población marcada con pulso de HT-aggrER mostró una reducción sustancial de la vida útil de la fluorescencia (Fig. 3a, b).La fracción agregada se redujo sustancialmente de manera dependiente del tiempo después de la inducción del estrés de la proteína desplegada, a través de la inhibición de la N-glicosilación de las proteínas nacientes por la tunicamicina (Tm, Fig. 3c, d, ver inducción de marcadores de estrés ER y dosis / tiempo pruebas en la figura complementaria 5a, b, respectivamente).La carga de agregación disminuida se manifiesta en un porcentaje más bajo de celdas que muestran partículas agregadas grandes tipo puntos (vida útil > 5 ns, se destacan como píxeles codificados en color rojo, Fig. 3a, c) y la reducción del área ocupada por estos agregados grandes (Figura 3d).Además, en las imágenes FLIM de las células tratadas con tunicamicina, la distribución completa del tiempo de vida de la fluorescencia de los píxeles se desplazó gradualmente hacia valores más bajos en casi todas las células (Fig. 3b).Esto indica que los intermedios oligoméricos de mayor duración de la sonda (demasiado pequeños para ser detectados como puntos) también se eliminan.Se observó un efecto similar para la variante HT-aggrER más propensa a la agregación M21K-F86L (Fig. 6 complementaria).Además, la sonda enfrentó un destino similar en las neuronas corticales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC): en estas células, también, HT-aggrER formó agregados puncta-like con una vida útil más larga, mientras que la inducción de estrés ER por tunicamicina redujo la agregación. carga (Fig. 7 complementaria).A continuación, examinamos los mismos parámetros de agregación en las células antes y después de la inducción del estrés del ER por otros medios, agotando el calcio del ER a través de la inhibición de las bombas SERCA-ATP-asa por la tapsigargina.La eliminación de agregados en estas condiciones de estrés de ER también fue evidente a través de un cambio de las distribuciones de píxeles de vida útil de fluorescencia de la sonda hacia valores más cortos, fracciones reducidas de células con agregados y una contracción del área celular ocupada por agregados (Fig. 3e-h).a, e Imágenes FLIM de células CHO-K1 vivas que expresan de forma estable HT-aggrER, no tratadas o tratadas con tunicamicina (Tm a 0,5 µg/mL) o tapsigargina (Tg a 0,5 µM) durante un período de tiempo posterior al marcaje por pulsos con P1 fluorocromo como se indica.b, f Histogramas que representan la distribución de frecuencias de la vida útil de la fluorescencia de píxeles de la serie de imágenes como en (a, e), tenga en cuenta el cambio hacia valores de vida útil más cortos después del tratamiento (las trazas representan células individuales, control sin tratar, rosa; tratamiento de 5 h, amarillo; 18 h tratamiento, verde).c, g Cuantificación del número relativo de células con agregados detectados por FLIM en imágenes como en (a, e).d, h Gráficos del área de celda relativa ocupada por agregados detectados por FLIM (vida útil> 5 ns, puntos rojos) en imágenes como en (a, e).Media ± SEM, n = 10, 5, 6, 4 campos de visión independientes que contienen al menos 12 celdas cada uno (c, d, g, h), respectivamente.*P < 0,05;**P < 0,01;***P < 0,001;****P < 0,0001, prueba T no pareada (dos colas).Como el modo de obtención de imágenes de pulso-persecución excluye la contribución de los cambios en la formación de agregados de especies recién sintetizadas, el sorprendente efecto del estrés del RE impuesto sobre la abundancia de la fracción agregada de la sonda se explica por la activación de mecanismos que mejoraron la degradación de proteínas por autofagosoma/ maquinaria lisosomal o por una actividad de desagregación en el RE (hasta ahora desconocida).Presumiblemente, la eliminación mediada por proteasoma de la sonda agregada al ER también debería requerir su desagregación antes de la retrotranslocación al citoplasma, donde residen los proteasomas.Para distinguir entre los dos escenarios, primero investigamos la rotación de HT-agrER en condiciones de estrés y sin estrés.La maquinaria de control de calidad de ER atiende a los sustratos propensos a plegarse incorrectamente: reduce la expresión de las variantes al aumentar su rotación (Tabla 1, Figura complementaria 8, Película complementaria 2 y Película complementaria 3).Sin embargo, la inducción del estrés de ER ralentizó las tasas de degradación de las variantes de las sondas WT-HT y HT-aggrER (Tabla 1, Fig. 8 complementaria, Película complementaria 4 y Película complementaria 5).Además, el aclaramiento de agregados evolucionó en una escala de tiempo más rápida que la degradación de las sondas bajo tensión (Fig. 3, Tabla 1).Además, el efecto de reducción agregada del estrés ER fue insensible a los bloqueadores autofagosomales / lisosomales (Fig. 9 complementaria).Por lo tanto, el efecto antagonista de la agregación de proteínas del estrés del RE no puede explicarse por una degradación autofagosómica/proteasómica mejorada, pero es consistente con la actividad de desagregación activa del orgánulo.Hasta este punto, el seguimiento del destino del HT-aggrER revela una capacidad inducible del ER para resolver los agregados de proteínas formados a partir de una fracción que eludió el control de calidad del orgánulo.Esto plantea la cuestión de la identidad del (de los) catalizador(es) de desagregación de ER.En el citoplasma, la red de chaperonas de Hsp10022 (ausente en los metazoos) y Hsp70, alimentada por ATP, puede catalizar la solubilización de agregados de proteínas8,9,10.Las nociones de que esta última es la única maquinaria de mamíferos actualmente conocida con evidencia de actividad de desagregación a través de una energía/mecánica plausible8,9,10, y que el funcionamiento paralelo entre los análogos de chaperonas citoplásmicas y del RE son comunes, conducen a los análogos del RE como candidatos. desagregar maquinaria.Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la chaperona ER BiP análoga a Hsp70 esencial puede ser responsable de la actividad de desagregación del orgánulo.La candidatura de BiP para este papel está respaldada por su respuesta postraduccional/transcripcional al estrés del RE, una condición en la que observamos la actividad de desagregación (Fig. 3).Es decir, la UPR aumenta la abundancia de BiP y modula su actividad modificando el estado de oligomerización y modificación postraduccional de la chaperona23 antes de su regulación positiva y expansión de ER.La eliminación específica de esta chaperona molecular endógena clave mediante el tratamiento de las células con citotoxina subtilasa (SubAB) aumentó considerablemente la fracción agregada de la sonda (SubAB es una toxina de cepas toxigénicas Shiga de E. coli con una subunidad A proteolítica que se dirige específicamente a BiP y a la subunidad B responsable de internalización y tráfico retrógrado de la toxina al RE24, Fig. 4a-c).La eliminación de calreticulina, una chaperona central del sistema paralelo de asistencia al plegamiento de proteínas BiP ER, por parte de KO25 no afectó la carga de agregación de HT-aggrER (Fig. 10 complementaria), lo que argumenta en contra de la posibilidad de una mejora de agregación genérica del plegamiento de proteínas comprometido.El efecto de mejora de la agregación de la neutralización de BiP con SubAB se exacerbó al estresar la sala de emergencias con tunicamicina (Fig. 4a-c).a Imágenes FLIM de células CHO-K1 vivas que expresan de forma estable HT-aggrER (K73T), sin tratar, tratadas con citotoxina AB subtilasa (SubAB a 0,4 μg/ml) o con SubAB más tunicamicina (Tm a 0,5 μg/ml) durante 24 h, imágenes representativas de tres experimentos independientes.b Cuantificación del número relativo de células con agregados detectados por FLIM en imágenes como en (a).c Cuantificación de la fracción del área de la celda ocupada por agregados en imágenes como en (a).d Imágenes FLIM como en (a) para células transfectadas con vectores CRISPRa con ARNg específico dirigido al promotor BiP o con secuencia no específica (simulacro), imágenes representativas de dos experimentos independientes, consulte la Fig. 11 complementaria para la validación CRISPRa.e cuantificación de agregados como en (b).Media ± SEM, n = 6, 6, 4 campos de visión independientes como en la Fig. 3 para (b, c, e), respectivamente.*P < 0,05;**P < 0,01;***P < 0,001;****P < 0,0001, prueba T no pareada (dos colas).Para probar si la elevación de la expresión de BiP reduciría la carga de agregación, mejoramos la transcripción de su locus genómico mediante la activación CRISPR/Cas9 (CRISPRa).Este enfoque permite una mejora adicional de la expresión de objetivos con altos niveles de expresión endógena, como BiP (a diferencia de la entrega ectópica de ADNc exógeno en el plásmido), y logró un aumento de aproximadamente tres veces en la expresión de BiP a nivel de ARN (Fig. 11a-c).La regulación positiva de CRISPRa condujo a una disminución significativa en la carga de agregación de la sonda (Fig. 4d, e).Estas observaciones respaldan el papel del BiP en la desagregación.Además, señalan la importancia de un equilibrio en la cantidad de BiP para el plegamiento de proteínas nativas evitando la agregación, a través del aumento en los niveles de proteínas desplegadas (p. ej., como resultado de la sobreexpresión de HT-aggrER) que se compensa con éxito con un aumento en BiP, restaurando /preservando la homeostasis, su eliminación no puede ser así compensada.Para determinar aún más la capacidad de BiP para facilitar la desagregación, buscamos reconstruir esta reacción in vitro.Dado que las proteínas J-Domain (DnaJs/ERdjs) modulan la actividad HSP70/BiP y son cruciales para reclutar la chaperona en sus sustratos, fusionamos la sonda HT-aggr con un J-Domain26 genérico mínimo (HT-aggr-JD), una solución para mejorar la hidrólisis de BiP ATP imitando la dinámica natural de BiP/co-acompañante/sustrato anulando las incertidumbres asociadas con las especificidades de sustrato de las diversas proteínas J.El JD fusionado con HT-aggr parecía funcional ya que reclutó a BiP e interfirió con la oligomerización inducida por ATP de BiP27, a diferencia de HT-aggr sin JD (Fig. 5a).De manera crítica, la tendencia a formar agregados con un calentamiento suave se conservó en la fusión HT-agr-JD (Fig. 5b).Una rampa de calor trazada por dispersión de luz estática mostró que la incubación a 53 ° C es suficiente para llevar a cabo la agregación de HT-aggr-JD (Fig. 12a complementaria, traza magenta de la Fig. 5b).Con base en esto, asumimos que el HT-aggr-JD agregado, con su dominio J en cis, puede permitir observar la capacidad de la chaperona, si existe, como un núcleo disgregado.De hecho, la fracción agregada de la sonda atrajo a BiP WT pero no a su mutante deficiente en unión al sustrato (BiP V461F, Fig. 5c, reflejado en un pico de absorbancia más alto de la fracción agregada en presencia de BiP WT).Llamativamente, la fracción de agregación de la mezcla disminuyó con el tiempo a favor de las especies de bajo peso molecular (Fig. 5d).Para desmezclar el estado de agregación de HT-aggr-JD en la mezcla BiP/sustrato, monitoreamos la sonda a través de la fluorescencia de su ligando.De acuerdo con las lecturas de absorbancia UV, esto mostró un cambio dependiente de BiP/ATP y del tiempo de agregados hacia especies más pequeñas (Fig. 5e).En ausencia de BiP, o si no se proporciona el combustible ATP de la chaperona, los agregados no solo permanecen estables sino que continúan creciendo hasta un punto en el que son demasiado grandes para pasar el filtro de cromatografía (Fig. 5f, Fig. 12b complementaria) pero fácilmente detectable por análisis de dispersión de luz dinámica (Fig. 5f, recuadro).Se observó el mismo comportamiento cuando la sonda agregada que carecía de J-Domain se proporcionó como sustrato (Fig. 12c complementaria).Estos resultados indican que BiP alimentado con ATP puede desentrañar agregados de proteínas preformados.Vale la pena señalar que las mediciones in vitro no recapitulan la cinética de este proceso con precisión, ya que la maquinaria de asistencia de BiP es difícil de representar en toda su complejidad.a Trazas de absorbancia de proteína (280 nm) de BiP WT (50 µM) solo (gris), con HT-aggr nativo (azul oscuro) o HT-aggr nativo, fusionado con el dominio J (HT-aggr-JD, 10 µM) (azul claro), resuelta por cromatografía de filtración en gel (rango de fraccionamiento de 10–600 kDa).b Trazas como en (a) de HT-aggr nativo (verde), HT-aggr-JD nativo (azul claro) y HT-aggr-JD agregado por calor (53 °C, 20 min, 10 µM) (magenta).c, Rastros como en (a, b) de agregados como en (b) HT-aggr-JD, incubados con BiP WT/ATP (magenta) o BiP V461F/ATP (naranja), un mutante de BiP deficiente en unión a sustrato.Obsérvese el aumento en el pico principal de HT-aggr-JD agregado (rojo pálido) tras la adición de BiP WT/ATP únicamente, indicativo de su incorporación a los agregados.d Trazas como en (a, b) de agregados como en (b) HT-aggr-JD, incubados con BiP WT/ATP durante los períodos indicados (4 h, magenta; 24 h, naranja; 48 h, azul claro).e Trazas de fluorescencia de cromatogramas como en (d) esta vez detectando exclusivamente HT-aggr-JD (preagregado) a través de la fluorescencia de su marcador de ligando P2-halo (HT-aggr-JD, rojo pálido; 4 h, magenta; 24 h, naranja; 48 h, azul claro).f Rastros de fluorescencia de cromatogramas para el HT-aggr-JD marcado con P2 (preagregado) en ausencia de BiP para el mismo curso de tiempo y colores de trazo que en (e).Se midió la fluorescencia para puntos de datos discretos, 0,3 ml cada uno.Las mediciones de dispersión de luz dinámica que muestran el diámetro hidrodinámico (Dh) de HT-aggr-JD marcado con P2 (preagregado) para el mismo curso de tiempo se trazaron en el recuadro para revelar el crecimiento de los agregados en ausencia de BiP y explicar por qué los agregados se retienen en el prefiltro de la columna, lo que reduce la cantidad eluida con el tiempo.Las mediciones en (a–f) se realizaron en presencia de ATP (3–9 mM), que eluye a 20,2 ml, fracciones omitidas del cromatograma.En conjunto, los hallazgos del estudio actual revelan que el programa de respuesta al estrés de ER contiene el brazo de la desagregación inducible.Esto complementa su capacidad para preservar la proteostasis al mejorar el plegamiento y reducir la carga de proteínas cliente (mediante la expansión de chaperonas y la síntesis atenuada de proteínas/mayor degradación, respectivamente).La respuesta de PN de tres capas explica la capacidad del orgánulo para mantener la fabricación de proteínas de alta fidelidad que induce la desagregación en un espacio lleno de especies nacientes/plegables.Aunque no se puede excluir la posibilidad de la participación de desagregaciones adicionales, el sistema BiP parece ser la única máquina molecular residente en el RE con tal potencial.Los mecanismos de reutilización de BiP de una chaperona tipo holdasa/foldasa a una desagresión pueden contener pistas para identificar estrategias para antagonizar agregados/semillas tóxicas que evaden el sistema no estresado (p. ej., oligómeros A-beta28).1.2.Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable.Los datos de origen se proporcionan con este documento.Ciencia de las proteínasLetón.Nat.Rev Mol.Biol celular.J. Cell Biol.Nat.Rev Mol.Biol celular.Angew.químicaEn t.ed.físicaquímicaquímicafísicaJ. Microsc.bueyJ. Cell Biol.proc.Academia Nacional.cienciaNat.Métodos.cienciaBiol.J. Cell Biol.Nat.comúnactualBiol celular.Nat.actualOpiniónEstructura Biol.Exp. J.Medicina.Nat.Biol celular.Los autores declaran no tener conflictos de intereses.Los informes de los revisores están disponibles.Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedItSi encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.